經過前期對多糖的提取，去除蛋白質、色素、小分子等物質得到粗多糖，而這些粗多糖其實是由很多分子量、結構不同的多糖混合而成。為了得到純的多糖即均一性多糖，仍需進一步對這些粗多糖進行分離純化。

　　1、分步沉淀法

　　多糖的結構和分子量不同，其極性大小不同，在有機溶劑（如醇或酮）中的溶解度不同，根據這一原理，可以依此增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉淀出來。但是分級沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱層析法等進一步純化，方可得到均一性的多糖。

　　2、柱層析法

　　要獲得均一性的多糖，一般是先經過陰離子交換柱進行粗步純化，然后再用凝膠柱進一步純化。有些多糖也采用大孔樹脂柱進行純化。下面對這三種柱層析法進行詳細介紹。

　　3、陰離子交換法

　　一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類和高等植物的多糖進行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱對大杯香菇等菌類、玉米等植物、桑黃等藻類粗多糖進行分離純化。使用DEAE-52填料進行多糖的初步分離純化，該柱子一般直徑偏大，其中以2.6cm多，操作過程中流動相的流速也較快，流速一般在0.7-2ml/min之間，以1ml/min多，至于柱子的長度，選擇范圍較廣，從25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在對菌類、植物和藻類粗多糖的初步分離純化中，在選擇層析柱的直徑、流速和長度的方面與DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流動相都是純水和不同濃度的NaCl溶液。

　　4、凝膠色譜法

　　凝膠色譜法根據被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關系實現分離，類似于分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（SephadexG）、SephadexLH-20、聚丙烯酸凝膠ToyopearlHW等。多糖的進一步分離往往會選擇用各種凝膠進行分離純化。選擇使用哪一種凝膠對多糖進行純化的標準是多糖的分子量，不同種類和型號的凝膠能夠分離多糖類型和分子量范圍不同。凝膠柱的柱子規格常具有長而細的特點，直徑以1.6cm偏多。無論什么類型的凝膠柱，流動相多為蒸餾水或者一定濃度的NaCl溶液。